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Parutions

 

SunRiSE : mesurer la vitesse de synthèse des protéines par cytométrie de flux

 

La vitesse à laquelle les ribosomes synthétisent les protéines influe sur l'efficacité du repliement des protéines et la stabilité de l'ARNm et a récemment été proposée comme un nouveau moyen de régulation de l'expression génique. Mesurer cette vitesse ex vivo, notamment au niveau de la cellule unique est un véritable défi. Les chercheurs ont développé une méthode, baptisée SunRiSE, qui permet 1) de déterminer la vitesse moyenne à laquelle les ribosomes traduisent les protéines, 2) d'interroger en parallèle différentes populations cellulaires et 3) d'identifier les facteurs ayant un impact sur cette nouvelle régulation de l'expression génique.

 

Le processus de synthèse des protéines, appelé traduction, est assuré par la progression des ribosomes le long des ARN messagers (ARNm). Les chercheurs ont développé une méthode, "SunRiSE", pour analyser la dynamique et la vitesse des ribosomes qui se déplacent le long des ARNm. Cette méthode est basée sur l'utilisation d'un inhibiteur très spécifique et puissant qui agit comme une barrière et bloque l'initiation de la traduction. Ils mesurent alors l'évolution du nombre de ribosomes associés aux ARNm en prenant des instantanés toutes les 30 secondes. Si ce nombre de ribosomes est constant, cela signifie que les ribosomes sont bloqués. Par contre, si le nombre diminue, cela signifie que les ribosomes avancent au rythme correspondant.

Cette méthode permet de déterminer, en parallèle, la vitesse de traduction de chaque type de cellule ou état cellulaire présent dans un échantillon. Pour cette raison, et en raison de sa simplicité, SunRiSE est particulièrement intéressante pour les chercheurs qui veulent étudier la traduction des protéines dans les échantillons sanguins des patients ou les modèles animaux. La sensibilité de SunRiSE permet d'analyser des cellules rares difficiles, voire impossible à étudier avec d'autres techniques.

Comme elle peut être appliquée à la cytométrie de flux, cette méthode permet la surveillance simultanée de multiples paramètres, tels que l'activité de signalisation mTOR ou S6K1/2, l'étape du cycle cellulaire et la phosphorylation des facteurs de traduction dans des cellules individuelles, sans procédures de purification élaborées, coûteuses et longues. Les chercheurs ont ainsi démontré que, dans des fibroblastes embryonnaires de souris, la phosphorylation de l'eEF2 (facteur d'élongation) par la kinase eEF2 (eEF2K) affecte principalement la quantité des ribosomes engagées en traduction, mais a un effet étonnamment faible sur l´élongation en cellules non-stressées. L´effet prévu de la kinase eEF2K sur l´élongation des ribosomes est observable et jeu un rôle important après induction du stress protéo-toxique.

Figure : A mix of cells are stained with a panel of fluorochrome-labeled antibodies to identify the cells of interest (i.e. red cell). Cells are splited and treated with an inhibitor that block initiation of protein synthesis, (red blocking arrow) for different amounts of time. The remaining level of translating ribosomes are determined by the amount of puromycin incorporation using a fluorescent anti-puromycin antibody. The decay in fluorescence follows a one-phase log decay curve from which the K value is obtained as a measure of the speed of translation.

© Rafael Argüello

 

 

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Contacts chercheurs

  • Philippe Pierre

    Tél. +33 4 91 26 94 00

    Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy (CIML), CNRS

    UMR7280 (CNRS / Inserm / Aix Marseille Université)

    Marseille 13 288, France

     

 

Mise en ligne le 4 cotobre 2018

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